文丨小泥沙

席卷全球的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19, 簡稱新冠肺炎)由一種新型單鏈RNA冠狀病毒引起，國際病毒分類學委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)將該病毒命名為SARS-CoV-2。SARS-CoV-2 的生命周期主要包括病毒附著、膜融合、基因組復制、病毒粒子組裝和釋放。當前，針對 SARS-CoV-2 的藥物研發主要以病毒生命周期中的一個或多個事件為靶標來阻止病毒復制，如阻斷刺突蛋白與血管緊張素轉化酶 2（ACE2）結合和抑制病毒膜與宿主細胞融合或抑制3CL 蛋白酶（3C-likeprotease, 3CLpro）和木瓜蛋白酶（PLpro）或抑制依賴 RNA 的 RNA 聚合酶（RdRp）等。現階段針對 SARS-CoV-2 的口服小分子藥物已取得突破性進展，多種治療藥物已進入Ⅲ期臨床試驗。

RNA聚合酶（RdRp）抑制劑

1 莫努匹韋（ molnupiravir）

莫努匹韋(molnupiravir, MK-4482, EIDD-2801)是2021年11月4日英國藥品與健康產品管理局(Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency, MHRA)批準上市的第一款用于成年人輕度至中度新冠感染治療的RdRp口服抑制劑藥物。莫努匹韋在整個臨床試驗(Ⅰ~Ⅲ期：NCT04392219、NCT04405570、NCT04405739、NCT04939428、NCT04575597、NCT04575584)中均表現出針對新冠肺炎患者較理想的治療效果和安全性。莫努匹韋在SARS-CoV-2感染的Vero細胞中的抗病毒藥效約為EC50=0.3 μmol/L，在人呼吸道上皮細胞中抗病毒復制的藥效為EC50=0.14 μmol/L。體外毒性數據顯示，針對Vero細胞的CC5010 μmol/L，毒性與藥效的安全窗口較為理想，因此莫努匹韋被選定為臨床候選化合物。科學家在藥效機理研究中發現，莫努匹韋能有效插入SARS-CoV-2病毒的RNA模，促進病毒的突變和復制終結。細胞培養中的臨床前數據顯示，發生G到A和C到U轉換突變的病毒RNA數量在莫努匹韋作用下劑量依賴性增加，這與莫努匹韋的抗冠狀病毒藥效成正相關。因此，莫努匹韋被歸類為誘變核苷酸類似物。科研人員用SARS-CoV-2純化的RdRp蛋白酶結合病毒RNA復制測試評價，研究了藥物潛在的生化機制，即莫努匹韋作為前藥在血漿中代謝為N 4-羥基胞苷(EIDD-1931)，該活性主體分子進入宿主被感染細胞后，經激酶磷酸化形成N-羥基胞苷三磷酸作為藥物活性成分，參與病毒RNA復制過程并誘導RNA復制突變體的產生，最終導致病毒復制終止。

2021年3月默克公司(Merck)的Ⅱ期臨床結果顯示，從第5天接受該藥治療的新冠肺炎患者，在所有劑量組均達到了病毒陽性檢出率為0%(安慰劑組為24%)的效果。最新的Ⅲ期臨床結果顯示，莫努匹韋受試者在死亡和住院風險兩項指標中均降低了50%. 接受莫努匹韋治療的患者在隨機分組后的第29天住院或死亡的概率為7.3%，而安慰劑治療的患者為14.1%。在安全性方面，莫努匹韋治療組因藥物相關不良事件而終止治療的受試者約為1.3%，治療組和安慰劑組發生任何級別不良反應的比率分別為35%和40%。

2 瑞德西韋（ remdesivir）

瑞德西韋(remdesivir, GS-5734)是美國吉利德科學公司的一款在研核苷類似物前藥，可以從核糖衍生物經由多步反應合成獲得，為一種核苷類似物的前體藥物，通過RdRp 有效地結合到新生 RNA 鏈中，從而導致病毒復制提前終止。對絲狀病毒和冠狀病毒等多種病毒科病毒具有廣譜抗病毒活性，半最大效應濃度（EC50）值范圍為0.0035～0.75 μmol/L-1。體外試驗已證實瑞德西韋對 SARS-CoV-2 的有效抗病毒活性。瑞德西韋通過靜脈給藥，30～120 min 輸注，其在血漿中很容易檢測到，并在輸注結束時達到峰值濃度，隨后迅速消失（中位時間 0.5～1 h）。在體外試驗中，瑞德西韋可以抑制SARS-CoV-2(在Vero E6細胞中的EC50=0.77 μmol/L)。但是針對該藥物有效性的臨床研究產生了前后矛盾的結果。基于自適應性COVID-19治療試驗(adaptive clinical design)的結果，美國FDA已經批準該藥物治療COVID-19住院患者。而世界衛生組織基于“團結實驗項目(solidarity clinical trial)”則認為，該藥物在提高患者生存率或降低患者對吸氧的需求等方面沒有產生有意義的影響。

瑞德西韋是被批準用于治療 COVID-19 的第一個藥物，已在日本、澳大利亞、韓國、加拿大、以色列等全球多個國家注冊批準用于治療 COVID-19 患者。根據藥物作用機制及目前已有研究結果表明，瑞德西韋對重型/危重型患者效果差，臨床治療時應盡早、及時應用。但其給藥方式的局限，限制了臨床早期用藥。

3 法匹拉韋（ favipiravir）

法匹拉韋(Favipiravir, T-705)被用于新發或復發流感的治療。工業上主要以3-氨基吡嗪-2-羧酸為原料，經羥基化、酯化、氨解、硝化、還原、重氮化等反應制得，收率較低，生產成本較高。法匹拉韋是一種前藥，作為一種鳥嘌呤類似物，在進入受感染細胞后，通過模擬鳥苷三磷酸(GTP)嵌入延伸的RNA鏈中競爭性抑制RdRp，從而抑制病毒基因組的復制和轉錄，實現抗RNA病毒(例如流感病毒、埃博拉病毒、黃熱病毒、奇昆古尼亞病毒、諾如病毒和腸病毒等)的作用。鑒于它對SARS-CoV-2也具有良好的體外抑制活性(在Vero E6細胞中EC50=61.88 μmol/L)，法匹拉韋于2020年5月率先在印度獲得了新冠肺炎治療的“緊急使用授權”，隨后俄羅斯衛生監管部門也賦予了該藥物針對新冠肺炎患者的緊急使用授權。法匹拉韋在日本已經完成了針對新冠肺炎危重病人的Ⅲ期臨床試驗，目前正處于“預注冊”階段。法匹拉韋在臨床階段的結果仍存在爭議，不過在預催化狀態下與SARS-CoV-2的RdRp復合物冷凍電子顯微鏡結構研究發現，該藥物除非在模板RNA中遇到重復的嘧啶殘基，否則RNA產物中法匹拉韋的存在不會立即終止生長鏈的延伸，并且法匹拉韋能夠逃脫轉錄復制復合體(replication and transcription complex, RTC)的校對機制，導致后代病毒基因組發生突變，從而發揮抗病毒功效。這一發現解釋了該藥物在體外沒有顯著抑制RNA合成的現象。

目前，日本、俄羅斯、沙特阿拉伯、泰國、肯尼亞等國已在指南中推薦輕度至中度 COVID-19 患者使用法維拉韋口服治療。值得注意的是，法維拉韋對有生殖需求、痛風史和高尿酸的患者要謹慎使用，對于過敏、嚴重肝損害和腎損害的患者，禁用該藥。但結合藥物作用機制及多項臨床試驗的樂觀研究結果，法維拉韋仍有望成為 SARS-CoV-2 抗病毒治療的新選擇。

蛋白酶抑制劑

1、3C樣胰凝乳蛋白酶（3CLpro）抑制劑

3C樣胰凝乳蛋白酶(3C-like protease, 3CLpro,Mpro, nsp5)亦稱為M蛋白酶，是病毒復制過程必需的功能蛋白。該蛋白酶通過水解多聚蛋白pp1a、pp1ab中至少11個保守位點，以保證病毒轉錄復制關鍵非結構蛋白nsp4~16的生成，其中包括RdRp、解旋酶以及Mpro自己，并且Mpro不同毒株之間具有高度同源性而與人類宿主細胞缺乏同源性。因此，M蛋白酶也被認為是抗病毒藥物開發的重要靶點之一。

美國輝瑞公司研究人員以SARS-CoV-2 Mpro為靶標，設計和篩選出了具有強效病毒抑制作用的臨床候選藥物PF-07321332。其在體外實驗中針對SARS-CoV-2 Mpro的酶抑制常數Ki為3.11 nmol/L，酶抑制活性為IC50=18.0 nmol/L，而針對SARS-CoV-2病毒感染的抗病毒活性為EC50=74~93 nmol/L。PF-07321332在臨床前試驗中具有比較低的口服生物利用度，在大鼠和犬的藥代動力學實驗中生物利用度保持在20%~25%，其原因在于PF-07321332本身是體內藥物代謝酶CYP3A4的代謝底物。鑒于此，在臨床試驗中采用了與CYP3A4強效抑制劑瑞托那韋(ritonavir)聯用的策略(NCT04756531)，以提高藥物在體內的半衰期和生物利用度。藥物與SARS-CoV-2的晶體結構顯示，藥物分子中的CN取代基以共價方式與蛋白酶中的Cys145殘基結合，但該共價結合模式在非可逆SARS-CoV-2抑制劑競爭實驗中被證實是一種可逆模式。

目前，已經完成了PF-07321332針對輕度及中度癥狀新冠病毒感染者的Ⅲ期臨床試驗研究。結果顯示，在1219名未接種新冠疫苗的成年患者中，發熱、干咳等新冠肺炎癥狀出現后3 d內服用本抑制劑的住院率從安慰劑組的7%降至0.8%，死亡率從1.8%降至0%。本藥物已于2021年11月申請美國FDA的緊急使用授權。

2、木瓜樣蛋白酶（PLpro）抑制劑

PLpro是剪切經宿主細胞翻譯機制表達的多聚蛋白pp1a和pp1ab的兩個關鍵蛋白酶之一(PLpro負責切割nsp1、nsp2和nsp3)，可以高活性地切割Lys48連接的多聚泛素和泛素樣分子干擾素刺激基因15(ISG15)的修飾來實現免疫逃逸。因此，當PLpro被抑制后，理論上可以實現病毒載量的降低以及宿主先天免疫系統的恢復。因其在病毒復制和宿主細胞控制中的多重作用，PLpro被認為是一個潛在的抗病毒靶點。

GRL0617最初是在2003年SARS暴發時開發的PLpro抑制劑。由于SARS-CoV-2的PLpro與SARS-CoV PLpro具有82%序列相似性和90%的結構相似性，研究人員針對前期具有SARS-CoV抑制活性的化合物開展了SARS-CoV-2抗病毒活性篩選。研究顯示，在SARS-CoV-2感染的Vero E6細胞中100 μmol/L的GRL0617能有效抑制SARS-CoV-2的胞內復制，抑制率達50%以上。為了驗證化合物的抗病毒復制作用與靶標的相關性，對其進行了體外細胞測試并獲得了該藥物與PLpro的共晶結構。體外測試結果表明，該抑制劑針對SARS-CoV-2的PLpro蛋白酶具有較強的抑制活性(IC50=2.1 μmol/L)，并且在Vero E6細胞中該藥物濃度達到100 μmol/L時無明顯的細胞毒性。

在當前COVID-19全球大流行以及SARSCoV-2 持續變異的背景下，研發出有效、安全的抗病毒藥物并廣泛推廣應用是降低疾病全球負擔的重要舉措。小分子藥物具有易吸收、分子體積小、能夠穿透細胞膜、易于大規模工業化生產的優點，預期未來這類藥物可在早期廣泛應用，降低重癥化率、降低病死率以及為早日戰勝新型冠狀病毒做出重大貢獻。

參考文獻：

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