編者按：最近，頂級學術期刊《科學》出版了一期“改變生物學的技術”專刊，為我們詳細介紹了幾項正在給生物學領域帶來創新的重磅技術。在今天的文章中，藥明康德微信團隊將與讀者朋友一起，了解冷凍電鏡40年的激蕩，以及它對未來新藥研發的影響。

“回答許多基本的生物學問題是非常容易的；你只要看看那東西！”理查德費曼教授，1965年諾貝爾物理學獎獲得者

正如費曼教授所說，結構生物學的核心在于“看清事物”。只要分辨率足夠高，能在原子層面看到很多生物分子的細節，那么它們的工作方式就不言而喻了。正是因為這個原因，從歷史上看，結構生物學領域的發現帶來了許多生物學突破，并促進了許多創新療法的發展。

在眾多讓人類“高清看世界”的技術中，X射線晶體學是生物學家使用最多的技術之一，它也讓人類獲得了大量的生物大分子。但是這種方法需要預先獲得這種高分子的晶體。雖然許多蛋白質和一些穩定的復合物可以產生足夠高質量的晶體，但對于膜蛋白或動態復合物來說，獲得晶體并不那么容易。

能否不依賴晶體采集，直接“觀察”這些大分子？自20世紀70年代以來，許多先驅者試圖用電子顯微鏡來解決這個問題。起初，它的分辨率并不令人滿意。然而，經過40年的發展，冷凍電鏡技術取得了突破，成為結構生物學的主流工具之一，與X射線晶體學形成了完美的互補。

單粒子冷凍電鏡的誕生

事實上，通過電子顯微鏡看清楚生物大分子并不容易。首先，和通常的照片一樣，電子顯微鏡得到的圖像是二維的，而生物大分子的結構是三維的。這個問題用一個巧妙的方法解決了：對于同一個生物大分子，我們可以從不同的角度得到它的二維圖片。通過將這些圖片整合在一起，可以重建三維結構。

電子顯微鏡遇到的另一個問題曾被認為是它的致命缺陷——。為了達到最佳效果，電子束必須處于真空環境中。因此，這些樣品也必須處于相同的真空中。對于生物大分子來說，這導致了一個嚴重的問題：真空導致的脫水會對樣品的結構完整性產生破壞性的影響。從機理的角度看，用電子顯微鏡觀察生物大分子似乎是一項不可能完成的任務。

“冷凍”樣品可以保持生物大分子的完整性。

1974年發表在《科學》期刊上的一項研究顯示了人類的智慧。加州大學伯克利分校的研究生肯尼斯泰勒和他的導師羅伯特格萊澤教授表明，生物大分子的結構完整性可以通過“冷凍”來保存。這一發現在20世紀80年代被雅克杜博切特教授及其同事發揚光大，基于這一發現發展起來的樣品制備技術直到現在也沒有太大變化。

研究人員還指出了電子顯微鏡的第三個問題：3354高能電子束的輻射可能會損傷生物樣品，從而限制電子束的強度。弱電子束導致低信噪比。理查德亨德森教授等人提出的一個解決方案是將結晶學的技術應用于電子顯微鏡的成像過程。隨著電子晶體學技術的發展，人們取得了一系列的進步，分辨出的結構的最高分辨率為1.9。

三位在冷凍電鏡領域做出開創性貢獻的科學家分享了2017年諾貝爾化學獎。

約阿希姆弗蘭克教授希望避免結晶來確認蛋白質的結構。他建議，通過拍攝同一蛋白質顆粒的大量獨立圖片，然后通過計算機整合這些圖片，有望獲得高清結構。這種創新的想法，結合樣品的冷凍制備，成為了我們今天所熟悉的“單粒子冷凍電鏡”。弗蘭克教授、杜博切特教授和亨德森教授也分享了2017年諾貝爾化學獎。

結構生物學的新紀元

單粒子冷凍顯微鏡技術為結構生物學帶來了新的突破，使其進入了一個新的時代。難以結晶的靶標的結構也可以展現在人類面前，膜蛋白就是這樣的例子。在這篇綜述中，來自加州大學舊金山分校的程一凡教授介紹了冷凍電子顯微鏡如何幫助我們獲得瞬時受體電位(TRP)離子通道的結構。

TRP通道超家族分為7類，在人類中共有27個成員。每個通道都有特定的生理功能，其中一些有望成為人類疾病治療的靶點。然而，除了這些通道中的幾個小域之外，人們對這些通道的結晶化嘗試往往以失敗告終，這也限制了這些目標的進一步發展。

2013年，這種困境告一段落。當年《自然》上的兩篇論文，利用單顆粒冷凍電鏡技術，獲得了TRPV1離子通道在三種不同狀態下的結構，使我們更好地理解了其“感受熱、激活痛通路”的功能。TRPV1結構的獲得再次強調了冷凍電鏡的巨大潛力。3354當去掉“獲得晶體”這一限速步驟后，我們就可以很快獲得膜蛋白的原子結構。據統計，在不到五年的時間里，每種類型的TRP通道至少有一個成員的結構被分析出來。

對于大規模的動態復雜體，冷凍電鏡向人類呈現了無法通過結晶獲得的結構，拼接就是一個極好的例子。過去，人們只能獲得碎片的原子結構或低分辨率的整體結構。借助單粒子冷凍顯微鏡，在幾年的時間里，我們獲得了不同工作狀態下剪接體的結構，從而拼接出其工作的全貌。這在以前是不可想象的。

冷凍顯微鏡領域前所未有的發展速度吸引了眾多制藥企業的目光。他們希望應用這項技術來優化藥物發現過程。

醫藥企業的嘗試

在去年11月的一篇《Nature Reviews Drug Discovery》綜述中，作者Mark Peplow博士盤點了制藥公司在冷凍電鏡領域的布局和嘗試。

對于大型藥企來說，在公司內部建設冷凍電鏡的能力是其布局的主要方向。——基因泰克正在組建內部冷凍電鏡團隊；輝瑞公司花了500萬英鎊使用新的冷凍顯微鏡；諾華公司還通過與弗里德里希米舍爾研究所的合作建立了自己的冷凍電子顯微鏡中心。諾華生物醫學研究所(NIBR)蛋白質科學負責人Christian Wiesmann表示，他們的冷凍電子顯微鏡中心已經取得了初步成果。使用冷凍電子顯微鏡，他們獲得了與小分子結合的蛋白質的結構，這可以指導藥物化學的發展。

對于其他制藥公司或生物技術公司，他們決定結成聯盟，共同使用冷凍顯微鏡工具。這一方面是出于成本的考慮，但更重要的是這種聯盟可以促進經驗的交流。在英國，劍橋制藥公司Cryo-EM財團就是這樣一個例子。——在五家制藥公司的合作下，這個財團獲得了超過300萬英鎊的資金，并于2016年正式啟動。

去年5月，該聯盟成員阿斯利康發表了一篇論文，揭示了人類突變ATM蛋白的結構。ATM蛋白是一種大激酶，與DNA修復有關，在癌癥發病中具有潛在作用。研究人員獲得的結構分辨率為4.4，足以看出它的兩種構象，其中一種處于“開放”狀態，可以與底物結合；另一個處于“關閉”狀態。這些發現帶來了這種蛋白質的第一個高清結構，也表明了它作為分子開關的重要作用。

聯盟的另一個成員赫普塔瑞斯正在探索GPCR的結構。作為一種膜蛋白，它們通常會因分離過程而失去正常的結構和活性，因此很難用常規的結晶方法制備樣品。然而，冷凍電子顯微鏡技術沒有這樣的麻煩。目前，我們獲得的GPCR的結構已經使我們能夠清楚地看到它們與大肽結合時的結構。它們與小分子結合時的高清結構將是研究人員未來的研究方向。

冷凍電鏡的未來

冷凍顯微鏡領域在過去的40年里發生了巨大的變化，這項技術還有很大的改進空間。重點之一是進一步提高分辨率到2左右，二是提高使用效率。如果能夠快速獲得大量樣本的高清結構，無疑將加速這一革命性技術在醫學領域的應用。

此外，硬件和軟件的升級也將提高冷凍顯微鏡的性能。更好的光學系統，更好的探測器，更好的算法軟件，可以讓冷凍顯微鏡比現有的更強大。正如一些業內資深人士指出的那樣，可能需要5到10年才能實現這樣的功能迭代，并使冷凍顯微鏡成為新藥發現的常規工具。但對于許多制藥和生物技術公司來說，這可能是將這一工具整合到R&D系統中的最佳時機。

本文標題來自Pixabay()

參考資料：

[1] Y Cheng (2018)，單粒子cryo-EM——它是怎么來的，又將去向何方，科學，

[2] M Peplow (2017)，低溫電子顯微鏡在制藥實驗室掀起波瀾，自然評論藥物發現，

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