關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)是單克隆抗體仿制藥研發(fā)的基準(zhǔn)，包括糖基化修飾、聚集性、電荷異質(zhì)性等。其中，糖基化修飾對(duì)單克隆抗體的生物活性、免疫原性、藥代動(dòng)力學(xué)、構(gòu)象、穩(wěn)定性和溶解性有重要影響。細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境，如pH、溫度、滲透壓、溶解氧等參數(shù)都會(huì)影響單克隆抗體的糖基化性能。本文對(duì)文獻(xiàn)中滲透壓、培養(yǎng)時(shí)間、溶解氧等培養(yǎng)控制參數(shù)以及溫度、剪切力、培養(yǎng)方式對(duì)糖基化影響的研究進(jìn)行了簡(jiǎn)要總結(jié)。

滲透壓和培養(yǎng)時(shí)間

通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或補(bǔ)料培養(yǎng)基中添加NaCl可以實(shí)現(xiàn)體系滲透壓的調(diào)節(jié)，從而考察滲透壓對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)產(chǎn)量和質(zhì)量的影響。renpacis團(tuán)隊(duì)將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的滲透壓分別準(zhǔn)備為300、330、360和400 mOsm/kg，補(bǔ)料培養(yǎng)基的滲透壓分別準(zhǔn)備為750和1250 mOsm/kg，取不同時(shí)間段的樣本進(jìn)行測(cè)試，然后研究滲透壓和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)糖基化的影響。實(shí)驗(yàn)中使用了CHO細(xì)胞。

滲透壓為300 mOsm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和滲透壓為750 mOsm/kg的補(bǔ)料培養(yǎng)基作為對(duì)照組。如圖1所示，對(duì)照組的Man5在第22天為15%，而當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的滲透壓為400 mOsm/kg時(shí)，對(duì)照組的Man5為18%。在類似的條件下，當(dāng)飼料的滲透壓增加到1250 mOsm/kg時(shí)，Man5的比例增加到23-27%。然而G0F的表現(xiàn)卻恰恰相反。滲透壓升高會(huì)導(dǎo)致G0F比值降低，不同滲透壓下的G1F差異不顯著。在renpacis實(shí)驗(yàn)中，隨著滲透壓的升高，Man5升高，G0F降低，G1F略有波動(dòng)。研究人員在CHO-B，C，D和e也發(fā)現(xiàn)了類似的情況。

圖1不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基(300、330、360和400 mOsm/kg)和補(bǔ)料培養(yǎng)基(750和1250 mOsm/kg)中的糖基化(a. Man5b. G0FG1F)(來自參考文獻(xiàn)1)

另外，從圖1中可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，Man5呈上升趨勢(shì)，而G0F和G1F均呈下降趨勢(shì)，這可能與蛋白質(zhì)的一些自發(fā)過程有關(guān)。而且在高滲透壓的情況下，細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，蛋白質(zhì)的產(chǎn)量也會(huì)下降。因?yàn)槿思?xì)胞表達(dá)的高甘露糖糖型(Man5-9)蛋白抗體一般在5%左右，所以通常不采用高滲透壓培養(yǎng)條件。

為了解釋滲透壓影響糖基化的機(jī)制，研究人員檢測(cè)了GnT-1 (N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I，它調(diào)節(jié)Man5和其他糖之間的連接)的mRNA水平。測(cè)量來自不同滲透壓組D3、7、12和14的樣品。結(jié)果表明，不同滲透壓組GnT-1 mRNA差異不大，滲透壓對(duì)Man5水平的影響可能是通過影響GnT-1酶活性或mRNA轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的。

溶氧(Dissolved Oxygen，DO)

作為細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)重要參數(shù)，在一般的實(shí)驗(yàn)規(guī)?；蛏a(chǎn)規(guī)模中通常設(shè)定為40%，但也有一些情況。一些學(xué)者認(rèn)為將DO范圍設(shè)定在25-50%是最佳的細(xì)胞培養(yǎng)條件，即使細(xì)胞可能缺氧；然而，將溶解氧維持在過高水平會(huì)加速過氧化物的形成，損害DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良。

有時(shí)，由于傳質(zhì)效果差或細(xì)胞的需氧量高，溶解氧會(huì)被設(shè)定在較高的水平，如60-80%。先不管這樣的參數(shù)設(shè)置是否真的能解決問題，先了解溶解氧對(duì)單克隆抗體糖基化的影響。關(guān)于DO對(duì)蛋白質(zhì)糖基化的影響，學(xué)者們的研究結(jié)果也不一致。例如，一些學(xué)者的研究表明，低水平的DO會(huì)降低半乳糖的糖基化，而另一些研究指出，DO不會(huì)影響半乳糖的糖基化。可見DO對(duì)糖基化的影響還與細(xì)胞系等因素有關(guān)。

VeronicaRestelli等人在2.4/4L培養(yǎng)體系中研究了3、10、50(對(duì)照)、100和200% DO對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)產(chǎn)量和糖基化的影響，并利用CHO-K1細(xì)胞系合成紅細(xì)胞生成素(EPO)。

VeronicaRestelli首先用弱陰離子交換柱分離EPO，然后分析蛋白質(zhì)的唾液酸化程度。測(cè)試結(jié)果如表1所示。所得樣品中的唾液酸化水平基本上為83-93%，平均水平為89%。除了100% DO的16.37%非唾液酸化外，其他水平DO的非唾液酸化基本相同。Veronica Restelli用HPLC檢測(cè)不同結(jié)構(gòu)類型EPO(復(fù)合、雜合、高甘露糖)的糖基化，結(jié)果表明DO的不同設(shè)定值對(duì)其沒有影響。

表1 DO對(duì)EPO唾液酸化的影響

在不同的DO設(shè)置(3、10、50、100和200%)下，蛋白質(zhì)的巖藻糖范圍為75-81%。如圖2所示，DO為50%或100%時(shí)，巖藻糖水平約為80%。當(dāng)DO為3、10和200%時(shí)，蛋白質(zhì)的平均巖藻糖含量為75-76%。即DO為50%或100%時(shí)，巖藻多糖的糖化水平最高，隨DO的增加或減少而逐漸降低。總的來說，在Veronica Restelli的實(shí)驗(yàn)研究中，EPO的糖基化修飾在較大范圍的DO中變化不大，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞系在相似的環(huán)境中對(duì)DO具有較高的耐受性。

Kunkel等人研究了DO對(duì)IgG半乳糖化的影響，并對(duì)DO的三個(gè)梯度(10，50，100%)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，增加DO濃度可以促進(jìn)IgG的半乳糖化，如圖3所示。當(dāng)DO為10%時(shí)，G2的含量為12%，而當(dāng)DO為100%時(shí)，G2的含量增加到30%。G1的變化并不明顯。

DO影響蛋白質(zhì)糖基化的機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為DO降低了細(xì)胞內(nèi)UDP-gal(尿苷二磷酸半乳糖)的利用率，進(jìn)而進(jìn)入高爾基體的前體減少。也有人認(rèn)為，早期含有二硫鍵的重鏈化合物會(huì)極大地影響半乳糖進(jìn)程。

溫度(Temperature)

生物反應(yīng)器溫度是控制細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白產(chǎn)量的重要手段，細(xì)胞培養(yǎng)的最佳溫度(T)一般為37左右。在培養(yǎng)初期，37的培養(yǎng)溫度可以獲得較高的細(xì)胞密度，而當(dāng)細(xì)胞密度接近峰值時(shí)，降低溫度至30左右是延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的常用手段，從而獲得較高的蛋白產(chǎn)量。

而變溫不僅可以提高蛋白產(chǎn)量，有研究發(fā)現(xiàn)低溫下細(xì)胞內(nèi)蛋白酶等毒性酶的活性會(huì)降低，從而在一定程度上提高蛋白的品質(zhì)?，F(xiàn)就溫度漂移對(duì)糖基化影響的相關(guān)研究做一簡(jiǎn)要綜述。

Michael等人研究了不同變溫時(shí)間(早期、中期和晚期)對(duì)唾液酸含量的影響。如圖1所示，冷卻時(shí)間越晚，細(xì)胞的峰值VCD越高，但冷卻時(shí)間對(duì)唾液酸含量的影響幾乎可以忽略不計(jì)。當(dāng)在早期(D3)、中期(D4)和后期(D5)調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度時(shí)，在第11天收集的樣品的唾液酸含量分別為0.98、0.98和0.92。此外，三種不同方案下D10和第12天的唾液酸含量基本相同。

也就是說，在邁克爾的研究體系中，D3、D4和D5調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度對(duì)唾液酸沒有明顯的影響，但會(huì)影響細(xì)胞的表達(dá)。此外，研究人員在沒有溫度漂移的情況下沒有實(shí)驗(yàn)控制數(shù)據(jù)，因此對(duì)溫度漂移對(duì)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)糖基化的影響的研究并不徹底。溫度變化對(duì)唾液酸總量無明顯影響，但對(duì)兩種形態(tài)唾液酸Neu5Gc和Neu5Ac的比重有明顯影響。當(dāng)溫度轉(zhuǎn)換時(shí)間延遲時(shí)，Neu5Gc水平明顯下降29-59%，影響了它們之間的相互轉(zhuǎn)化，但對(duì)總唾液酸含量沒有影響。

圖1不同溫度變化時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)(左)和蛋白質(zhì)唾液酸化(右)的影響(圖片來自參考文獻(xiàn)4)

在Mariela的另一篇文章中，他還研究了CHO-K1-hGM-CSF細(xì)胞系在不同培養(yǎng)溫度(37和33)下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、hGM-CSF產(chǎn)生和糖基化的影響。在實(shí)驗(yàn)組中，研究人員將一組實(shí)驗(yàn)一直保持在37，而另一組在細(xì)胞密度接近峰值時(shí)將溫度降至33。

發(fā)現(xiàn)低溫(33)有利于維持細(xì)胞活力，33時(shí)hGM-CSF的最高產(chǎn)量是37時(shí)的6倍。由于培養(yǎng)環(huán)境的變化對(duì)蛋白質(zhì)的質(zhì)量有重要影響，研究人員在兩個(gè)溫度下測(cè)量了HGM-CSF的糖基化，純化了hGM-CSF和脫鹽的hGM-CSF，然后確定了其寡糖結(jié)構(gòu)。測(cè)試結(jié)果如表1所示。沒有唾液酸化的hGM-CSF對(duì)巖藻聚糖的糖化保持不變(16.014.2，48.750.7%，35.3 35.1%)。而去唾液酸后的寡糖結(jié)構(gòu)在溫度調(diào)節(jié)后無明顯變化(18.717.0%，32.033.4%，32.534.0%，16.815.6%)，這意味著調(diào)節(jié)溫度對(duì)hGM-CSF糖鏈末端的唾液酸水平無明顯影響。即在Mariela的實(shí)驗(yàn)研究中，將培養(yǎng)溫度從37(細(xì)胞生長(zhǎng)階段)降低到33(蛋白表達(dá)階段)，可以改善細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，增加hGM-CSF蛋白的產(chǎn)量，同時(shí)對(duì)hGM-CSF的糖基化作用較弱。

表1 不同溫度時(shí)hGM-CSF的寡糖結(jié)構(gòu)比較

(圖表來自參考文獻(xiàn)5)

剪切力(Shear stress)

細(xì)胞培養(yǎng)中的剪切力可以認(rèn)為是兩層不同流速的培養(yǎng)液之間的摩擦力，細(xì)胞在這種“力”的作用下可能會(huì)提前死亡或溶解。有報(bào)道稱剪切力可以影響蛋白質(zhì)糖基化，但在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)中，剪切力對(duì)細(xì)胞性能的影響并不明顯。隨著培養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大或細(xì)胞的敏感性培養(yǎng)，剪切應(yīng)力成為工藝轉(zhuǎn)移或放大過程中不得不考慮的因素。

攪拌速度的變化會(huì)直接影響剪切力。Senger等發(fā)現(xiàn)，高剪切力可以使tPA上Asn184位點(diǎn)的糖鏈長(zhǎng)度減少，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的糖基化。Senger的研究將tPA的糖基化分為兩種類型，型(完全糖基化)和型(部分糖基化)。動(dòng)力學(xué)分析表明，高剪切應(yīng)力會(huì)產(chǎn)生兩種結(jié)果：tPA蛋白產(chǎn)量增加；型蛋白比例增加，型蛋白比例降低，即蛋白質(zhì)整體糖基化比例降低。Senger認(rèn)為高剪切力導(dǎo)致細(xì)胞過早死亡或溶解，導(dǎo)致tPA在er中停留時(shí)間短(糖基化過程首先發(fā)生在ER中，然后在高爾基體中進(jìn)一步加工)。在糖基化過程完成之前，一些蛋白質(zhì)被釋放到培養(yǎng)環(huán)境中，糖基化速率降低。

培養(yǎng)模式

細(xì)胞培養(yǎng)模式可分為分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、濃縮補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)等。目前，補(bǔ)料分批培養(yǎng)模式應(yīng)用最為廣泛，灌注連續(xù)培養(yǎng)模式也逐漸進(jìn)入人們的視野。培養(yǎng)模式的改進(jìn)主要集中在成本控制上，對(duì)細(xì)胞性能和蛋白質(zhì)量的影響也是需要考慮的因素。

學(xué)者Kunkel等人在研究細(xì)胞培養(yǎng)方式(分批、補(bǔ)料分批、灌注)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)質(zhì)量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)方式的改變對(duì)蛋白質(zhì)糖基化表型有明顯的影響，他們利用細(xì)胞CHO DG44生產(chǎn)SEAP。從整體糖基化率來看，Kunkel發(fā)現(xiàn)，與分批和補(bǔ)料分批相比，灌注培養(yǎng)模式產(chǎn)生的蛋白質(zhì)糖基化率最高，這可能與培養(yǎng)體系中谷氨酰胺的濃度有關(guān)。分批和補(bǔ)料分批培養(yǎng)中低濃度的谷氨酰胺限制了糖基化位點(diǎn)。

而對(duì)于高甘露糖型，其在分批、補(bǔ)料分批和灌注模式中的比例依次降低，這是由于培養(yǎng)時(shí)間不同，細(xì)胞存活時(shí)間不同(灌注補(bǔ)料分批)。在分批培養(yǎng)中，過早的細(xì)胞死亡導(dǎo)致蛋白質(zhì)從高爾基體中提前釋放，但正常的糖基化修飾沒有完成。然而，蛋白質(zhì)SEAP的唾液酸化率是相反的。分批、補(bǔ)料分批和灌注模式下的唾液酸化率分別為17.6%、31.6%和50.9%。作者的解釋是，早期細(xì)胞死亡或溶解可以釋放細(xì)胞質(zhì)中的唾液酸酶，從而降解糖鏈末端的唾液酸，從而降低唾液酸化率。

參考資料：

1.細(xì)胞培養(yǎng)條件對(duì)抗體N-連接糖基化的影響——什么影響高甘露糖5糖型

2.溶解氧對(duì)中國(guó)倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary的縮寫）細(xì)胞生產(chǎn)重組人紅細(xì)胞生成素及其糖基化的影響

3.優(yōu)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)的重組蛋白的細(xì)胞糖基化代謝

4.培養(yǎng)條件對(duì)中國(guó)倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary的縮寫）細(xì)胞產(chǎn)生的重組融合蛋白中N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)含量的影響

5.表達(dá)刺激因子的中國(guó)倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary的縮寫）細(xì)胞培養(yǎng)中的降溫：對(duì)生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量的影響

6.哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中最佳和一致的蛋白質(zhì)糖基化