要害質量參數是單抗仿造藥研發的標桿，包羅糖基化潤色、聚體、電荷異質性等，此中如糖基化潤色對單抗的生物活性、免疫原性、藥物代謝動力學、構象、穩定性及溶解度存在緊張的影響。細胞培養進程中細胞所處情況，如pH、溫度、滲透壓、溶氧等參數會影響到單抗糖基化顯示，本文便文獻中對滲透壓、培育工夫跟溶氧等培育控制參數，和溫度、剪切力跟培育形式對糖基化影響的研討停止了扼要總結。
滲透壓跟培育工夫
系統中滲透壓的調節可以經由過程向根底培養基或補料培養基中參加NaCl實現，從而考查滲透壓對細胞發展、卵白產量及質量的影響。Efren Pacis團隊將根底培養基滲透壓離別配制為300、330、360跟400 mOsm/kg，補料培養基的滲透壓為750跟1250 mOsm/kg，并取分歧時間段的樣品停止檢測，進而便滲透壓及培育工夫對卵白糖基化的影響停止研討，試驗進程中采取的為CHO細胞。
以滲透壓為300 mOsm/kg的根底培養基跟750 mOsm/kg的補料培養基為對照組，如圖1所示，D22地利對照組的Man5為15%，而當根底培養基的滲透壓為400 mOsm/kg時其Man5為18%；類似前提下，而將補料的滲透壓增長到1250 mOsm/kg時，Man5的比例增長到23-27%。而G0F的顯示則恰好相反，滲透壓降低時會招致更低的G0F比例，分歧滲透壓前提下G1F的差異性并不大。Efren Pacis的試驗中，跟著滲透壓的增長，Man5增長，G0F降低，G1F顛簸較小，研討職員正在CHO-B、C、D跟E中均發明了近似的環境。
圖1 分歧根底培養基(300、330、360跟400 mOsm/kg)跟補料培養基(750跟1250 mOsm/kg)時的糖基化顯示(a. Man5; b. G0F; G1F) (來源于參考文獻1)
另外，從圖1中借可以看出，跟著培育工夫的增長，Man5呈上升趨向，而G0F跟G1F均顯示為降低趨向，那能夠與卵白的一些自發過程有關。并且，下滲透壓環境下細胞的發展還會遭到抑止，卵白的產量也會降低。因為人類自身細胞抒發的卵白抗體的下甘露糖糖型(Man5-9)普通正在5%擺布，畸形環境下沒有采用下滲透壓的培育前提。
為注釋滲透壓影響糖基化的機理，研討職員對GnT-1 (N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶I，調控Man5與其他糖類鏈接)的mRNA程度停止了檢測。離別與分歧滲透壓實驗組D3、7、12跟14的樣品停止測定，檢測結果顯示分歧滲透壓組GnT-1的mRNA差異性很小，滲透壓對Man5程度的影響能夠是經由過程影響GnT-1酶活或是影響mRNA的轉錄。
溶氧(Dissolved Oxygen，DO)
作為細胞培養的一個緊張參數，普通試驗范圍或出產范圍中經常設置為40%，但也會存在個例。有學者認為將DO規模設置正在25-50%時是最優的細胞培養前提，即便細胞能夠會缺氧；而將溶氧保持正在過高水平時會加速過氧化物的造成，對DNA、卵白跟脂質等發生毀傷，也會招致細胞發展變差。
有時會由于傳質后果好或細胞對氧須要高而將溶氧設置很下，如60-80%，且沒有思量如許的參數設置是不是可以真正的解決問題，先相識下溶氧對單抗糖基化的影響。學者關于DO對卵白糖基化影響的研討成果也是沒有同等的，如有學者研討評釋低水平DO會降低半乳糖糖基化，而其他研討則指出DO不會影響半乳糖化，可見DO對糖基化的影響借與細胞系等因素有關。
VeronicaRestelli等正在2.4/4L的培育系統中研討了3、10、50(對照組)、100跟200%的DO對細胞發展、卵白產量及糖基化的影響，采取CHO-K1細胞系分解促紅細胞生成素(EPO)。
VeronicaRestelli起首用弱陰離子交流柱將EPO停止離散，然后再對失掉的卵白停止唾液酸化水平的剖析研討。其檢測成果如表1所示，正在所得樣品中唾液酸化程度根本皆正在83-93%，平均水平為89%。除100% DO的16.37%的非唾液酸化中，其他程度的DO的非唾液酸化基本一致。對EPO分歧布局類型(復合型、雜合型跟下甘露糖型)的糖基化研討，Veronica Restelli采取了HPLC的檢測方式，結果表明DO的分歧設定值對其不影響。
表1 DO對EPO唾液酸化的影響
分歧的DO設定(3、10、50、100跟200%)下卵白的巖藻糖化規模為75-81%，如圖2所示，當DO為50%或100%時巖藻糖程度最高為80%擺布；而當DO為3、10跟200%時，卵白的巖藻糖水均勻正在75-76%規模內。即當DO為50%或100%時，巖藻糖化程度最高，跟著DO的增長或降低而漸漸降低。整體來說，Veronica Restelli的試驗研討中EPO的糖基化潤色正在較寬的DO規模內變更較小，近似的情況下試驗中利用的細胞株對DO的耐受性下。
Kunkel等研討了DO對IgG半乳糖化的影響，其對三個梯度的DO (10、50、100%)停止了試驗，結果表明進步DO濃度可以增進IgG的半乳糖化，如圖3所示。當DO為10%的G2的含量為12%，而當DO為100%時G2的含量進步到30%，G1的變更隨DO的轉變并沒有較著。
DO對卵白糖基化影響的作用機制借沒有明白，有學者認為DO降低會細胞對UDP-Gal(Uridine diphosphate galactose，尿苷二磷酸半乳糖)的利用率，從而進而進入到高爾基體的前體物降低；另有的認為后期露二硫鍵的重鏈化合物會極大的影響半乳糖化進程。
溫度(Temperature)
生物反應器溫度是節制細胞發展及卵白產量的緊張手腕，細胞培養進程中最好培育溫度(Temperature T)普通為37℃擺布。培育后期37℃的培育溫度以取得較下的細胞密度，而當細胞密度瀕臨Peak時，降低溫度至30℃擺布是延伸對數期的常用手腕，以此可以失掉較下的卵白產量。
可是Temp Shift不單單可以進步卵白產量，有研討發明高溫前提下細胞內的蛋白酶及其他毒性酶的活性會降低，從而正在必然水平上進步卵白的質量，上面便Temp Shift對糖基化影響的相關研討停止扼要概述。
Michael等對分歧的Temp Shift工夫(初期、中期跟晚期)對唾液酸含量的影響停止了研討，如圖1所示，降溫工夫越晚細胞的Peak VCD越高，可是降溫工夫對唾液酸含量的影響簡直可以疏忽。當培育溫度正在初期(D3)、中期(D4)跟晚期(D5)停止調節時，研討與D11天樣測得的唾液酸含量離別為0.98、0.98跟0.92，另外正在三種分歧計劃下的D10跟D12天的唾液酸含量基本一致。
即正在Michael的研討系統中，D3、D4跟D5調節培育溫度對唾液酸不較著的影響，但會影響到細胞的顯示，此外研討職員并不已停止Temp Shift的試驗對比數據，是以Temp Shift對系統中卵白糖基化影響的研討并沒有完全。雖然Temp Shift對唾液酸總量的影響沒有較著，但其對唾液酸的兩種情勢Neu5Gc跟Neu5Ac的比重有較著影響。當推延Temp Shift工夫時，Neu5Gc程度明顯降低了29-59%，即影響二者的彼此轉換，但對整體的唾液酸量不影響。
圖1 分歧的Temp Shift工夫對細胞發展(左)及卵白唾液酸化(左)的影響(圖片來源于參考文獻4)
正在Mariela的另一篇文章中其借研討了CHO-K1-hGM-CSF細胞系關于分歧培育溫度，37℃跟33℃，對細胞發展、hGM-CSF產量及其糖基化的影響。正在實驗組中，研討職員將一組試驗一直保持正在37℃停止培育，而另一組是當細胞密度瀕臨Peak時降低溫度到33℃。
研討發明，高溫(33℃)對細胞的活率保持有利，而且33℃時hGM-CSF的最高產量是37℃下hGM-CSF最高產量的6倍。因為培育情況的轉變對卵白的質量有緊張的影響，是以研討職員便兩種溫度下hGM-CSF糖基化停止了測定，將hGM-CSF純化跟來唾液酸化后對其寡糖(oligosaccharide)布局停止測定，檢測成果如表1所示。hGM-CSF來唾液酸化后的巖藻糖化不根本連結穩定(16.0→14.2、48.7→50.7%、35.3→35.1%) ；而其來唾液酸后的寡糖布局正在溫度調節后不較著變更(18.7→17.0%、32.0→33.4%、32.5→34.0%、16.8→15.6%)，也便默示調節溫度對hGM-CSF糖鏈終端的唾液酸化程度不較著影響。即正在Mariela的試驗研討中，將培育溫度從37℃(細胞發展階段)降低至33℃(卵白抒發階段)可以進步細胞的發展形態，增長hGM-CSF卵白的產量，同時對hGM-CSF的糖基化影響幽微。
表1 分歧溫度時hGM-CSF的寡糖布局比力
(圖表來自于參考文獻5)
剪切力(Shear stress)
細胞培養中剪切力可以被認為是分歧流速的、兩個層面的培養液間的摩擦力，細胞正在這股“力”作用下能夠會提早殞命或消融。有研討報導剪切力可以對卵白糖基化形成影響，實驗室小規模培育時剪切力對細胞顯示的影響并沒有較著，而跟著培育范圍的擴展又或是細胞的敏感度培育，工藝轉移或是縮小時剪切力成為一個不能不思量的因素。
攪拌轉速的轉變可以直觀天影響剪切力，Senger等研討發明下剪切力可以降低tPA上Asn184位點的糖鏈長度，進而影響卵白糖基化。Senger研討過程中將tPA的糖基化分為兩種類型，Type I(完整糖基化)跟TypeII(部門糖基化)，經由過程Kinetic剖析得出下剪切力作用下會發生兩個成果：tPA卵白的產量增長；Type II型卵白比率增長，Type I型卵白比率降低，即卵白整體糖基化比率降低。剖析其緣故原由，Senger認為下剪切力形成細胞的提早殞命或消融，招致tPA正在ER(糖基化進程先產生于內質網「ER」，再到高爾基體中進一步加工)的停留時間過短，部門卵白借已實現糖基化進程便曾經被開釋到培育情況中，糖基化比率降低。
培育形式
細胞培養形式可分為批培育(Batch)、補料分批培養(Fed-batch)、稀釋補料分批培養(Concentrated Fed-batch)跟灌流培育(Perfusion)等，現階段使用最多的為Fed-batch形式，Perfusion連續培養形式也逐漸進入人們眼中，培育形式的改善次要集合于節制本錢，其對細胞顯示及蛋白質量的影響也是須要思量的因素。
學者Kunkel等正在細胞培養形式(Batch Fed-batch Perfusion)對細胞發展及蛋白質量影響的研討中發明，培育形式的轉變對卵白糖基化表型存在較著的影響，其采取細胞CHO DG44出產SEAP停止了相關試驗。從整體的糖基化比率來看，Kunkel發明與Batch跟Fed-batch比擬，Perfusion培育形式出產的卵白糖基化比率最高，其能夠與培育體系中谷氨酰胺濃度有關，Batch跟Fed-batch培育時低濃度的谷氨酰胺限定了糖基化的位點。
而關于下甘露糖型，其正在Batch、Fed-batch跟Perfusion形式中的比率依次降低，這是因為培育工夫長短不一、細胞存活工夫分歧(PerfusionFed-batchBatch)，正在Batch培育中細胞過早殞命招致卵白提早從高爾基體中開釋，而已實現畸形的糖基化潤色。而卵白SEAP的唾液酸化比率則呈相反的環境，Batch、Fed-batch跟Perfusion形式中的唾液酸化比率離別為17.6%、31.6%跟50.9%，關于一點作者的注釋是較早的細胞殞命或消融使細胞質中的唾液酸酶得以開釋，從而將糖鏈末尾的唾液酸降解，從而削減了唾液酸化比率。
參考文獻：
1.Effectsof Cell Culture Conditions on Antibody N-linked Glycosylation—What Affects High Mannose 5 Glycoform
2.The Effect of Dissolved Oxygen on the Production and the Glycosylation Profile of Recombinant Human Erythropoietin Produced From CHO Cells
3.Optimisation of the cellular metabolism of glycosylation for recombinant proteins produced by mammalian cell systems
4.Effects of Culture Conditions on N-Glycolylneuraminic Acid (Neu5Gc) Content of a Recombinant Fusion Protein Produced in CHO Cells
5.Temperature Reduction in Cultures of hGM-CSF-expressing CHO Cells: Effect on Productivity and Product Quality
6.Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture